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       Artículo de ciencia

El filtrado de partículas, herramienta básica en el análisis molecular y las investigaciones genéticas


 Biología / Medicina  Tecnología
Alejandro Serrano   01/04/2015
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     Breve descripción de un proceso esencial utilizado sobre todo investigación genética y forense.
El análisis molecular y las investigaciones genéticas se han vuelto indispensables en el ámbito científico, sanitario e industrial, así como en el entorno forense. Por esta razón, aunque es un tema que pueda parecer baladí al lector científico medio, es básico que los procesos y protocolos seguidos para aislar moléculas concretas, objeto de estudio o análisis, sean lo más seguros posible. Hoy día, existen métodos cada vez más refinados para filtrar partículas, según interese en un análisis determinado, y la tecnología existente básica es utilizable en volúmenes de amplio espectro.

En los planos sanitario y forense en especial, la extracción y purificación del ADN y el ARN –ácidos nucleicos- de tejidos es fundamental para la investigación médica básica y la resolución de procesos penales, y cuanto más refinado sea el método utilizado, mayor seguridad ofrece.

La extracción y purificación de ácidos nucleicos es la primera etapa de la mayoría de estudios de biología molecular y de las técnicas de recombinación de ADN. El proceso habitual para conseguirlo consiste en tres pasos fundamentales: ruptura (o lisis), purificación (eliminación de proteínas y contaminantes), y finalmente, recuperación del ADN.

La extracción de ácidos nucleicos de muestras biológicas comienza por provocar una ruptura de las estructuras que confinan el citoplasma, una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de otros tipos de células. Esta lisis ha de preservar el ácido nucleico objetivo (o “diana”) y al mismo tiempo ha de poder ocasionar una ruptura en el tejido complejo del que se parte.

Análisis de material genético

Las opciones para provocar esta lisis celular son variadas:

-Por rotura mecánica: el tejido puede congelarse en nitrógeno líquido y triturado, para romper la estructura general y ocasionar una ruptura de las paredes celulares.

-Por tratamiento químico: el tejido puede ser tratado con detergentes, agentes caotrópicos, etc.

-Por digestión enzimática: se utilizan enzimas para romper los polímeros del tejido y reducirlos a moléculas más pequeñas, a menudo con la Proteinasa K, que elimina la suciedad de las preparaciones de ácido nucleico.

Antes de la extracción, puede aplicarse la técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa), que permite amplificar regiones del ADN en laboratorio, de forma que un pequeño segmento, que podría pasar desapercibido en un análisis, se multiplique millones de veces y resulte evidente. Esta técnica es utilizada de forma rutinaria en la identificación de cadáveres y en investigación de crímenes, para buscar rastros concretos de sospechosos. También, en biología, se emplea para identificar cadenas genéticas de animales y plantas, o gérmenes virulentos.



Las ADN polimerasas tienen una propiedad natural, gracias a la cual replican cadenas de ADN. Se utilizan ciclos de temperaturas bajas y altas alternadas, para separar las hebras de ADN recién formadas tras cada frase de replicación, y a continuación dichas hebras vuelven a unirse y pueden ser duplicadas de nuevo. Esta reacción en cadena de la polimerasa, con temperaturas controladas, consigue que, gracias a una pequeña muestra de ADN, se identifiquen rastros que de otro modo no serían reconocidos.

Una vez provocada la lisis, para purificar estos ácidos nucleicos obtenidos, se puede seguir una combinación determinada de varios métodos:

-Extracción/precipitación: Se realiza una extracción con disolventes, de forma que se eliminan los contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, utilizando fenol y cloroformo pueden precipitarse las proteínas que convierten en impura una muestra, aunque depende del uso que se le vaya a dar al análisis, en ocasiones re requiere la utilización de agentes químicos no tóxicos. En la concentración de los ácidos nucleicos se puede realizar una precipitación con isopropanol o etanol, si la cantidad del ácido nucleico diana es poca, puede añadirse un portador inerte, como el glucógeno, que favorece la precipitación sin contaminar, o una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas (o de las proteínas mediante cambios del pH).

-Cromatografía: con permeación sobre gel, intercambio iónico, adsorción selectiva o unión por afinidad.

-Centrifugación: La centrifugación selectiva de la muestra es un método bastante eficaz de purificación. La ultracentrifugación en gradientes autogenerados con fuerzas g elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plásmidos.

-Separación por afinidad: Este método combina la inmovilización por afinidad de ácidos nucleicos y el Magnetic separation process (proceso de separación magnética). Para controlar este proceso, los investigadores se basan en que la suspensión de microesferas magnéticas es normalmente opaca. Durante el proceso de separación, la fase sólida se mueve a la zona de retención y el tampón se vuelve transparente. Una vez esto se produce, el proceso termina; puede verificarse a simple vista o utilizando –para mayor precisión, un espectrómetro.

Separación magnética de partículas

La monitorización con un método tradicional es en ocasiones bastante ardua, y la información a tiempo real difícil de analizar debido a variaciones de la fuerza magnética. Sin embargo, cuando se utiliza un sistema de separación biomagnética con fuerza magnética constante (como el que ilustramos), implementados más recientemente, la información proporcionada por la monitorización en tiempo real es mucho más fácil de analizar. La contribución del patrón de campo es uniforme, así que la dinámica de perlas magnéticas depende directamente del momento magnético y el diámetro.

Estos métodos permiten una separación más eficiente, que reduce las pérdidas de producto y al mismo tiempo facilitan la escalabilidad, reduciendo considerablemente los costes de tiempo y dinero en los procesos analíticos.

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